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Jun 27, 2023Jun 27, 2023

Nature Microbiology volume 7, pages 1376-1389 (2022)Citer cet article

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La variante SARS-CoV-2 Omicron a des niveaux de transmission très élevés, est résistante à la neutralisation par les anticorps monoclonaux humains (mAb) thérapeutiques autorisés et est moins sensible à l’immunité médiée par le vaccin. Pour fournir des thérapies supplémentaires contre Omicron, nous avons isolé un mAb nommé P2G3 d'un donneur vacciné précédemment infecté et avons montré qu'il avait une activité neutralisante de gamme picomolaire contre Omicron BA.1, BA.1.1, BA.2 et toutes les autres variantes testées. Nous avons résolu la structure du Fab P2G3 en complexe avec le pic Omicron en utilisant la microscopie cryoélectronique à une résolution de 3,04 Å pour identifier l'épitope P2G3 en tant que mAb de classe 3 différent des épitopes de pointe se liant au mAb rapportés précédemment. En utilisant un modèle de provocation chez le singe SARS-CoV-2 Omicron, nous montrons que P2G3 seul, ou en combinaison avec P5C3 (un mAb de classe 1 largement actif identifié précédemment), confère une protection prophylactique ou thérapeutique complète. Bien que nous puissions sélectionner des mutants du SRAS-CoV-2 échappant à la neutralisation par P2G3 ou par P5C3 in vitro, ils avaient un faible pouvoir infectieux et les mutations « d'évasion » sont extrêmement rares dans les bases de données de séquences publiques. Nous concluons que cette combinaison de mAb a un potentiel en tant que médicament anti-Omicron.

Le SRAS-CoV-2 est responsable de plus de 340 millions d’infections confirmées et de plus de 5,5 millions de décès dans le monde1. Sa propagation a entraîné l’émergence de variants préoccupants (VOC) plus transmissibles et résistants aux réponses immunitaires. Les COV hébergeant un nombre élevé de mutations par rapport à la souche originale du SRAS-CoV-2 prédominent, Delta (B.1.617.2) et ses 11 à 15 mutations de pointe étant désormais largement remplacés par la variante hautement infectieuse d'Omicron (B.1.1.529.1). ), qui contient jusqu’à 37 mutations d’acides aminés dans la protéine de pointe2,3. Quinze des substitutions de pointes dans Omicron se trouvent dans le domaine de liaison au récepteur (RBD), la région ciblée par les anticorps neutralisants (qu'ils soient induits par une infection ou par les vaccins actuels) qui ont tous été produits contre la souche originale de Wuhan 2019-nCoV4,5,6,7. ,8. Omicron résiste également à la neutralisation par la plupart des mAb anti-SARS-CoV-2 signalés jusqu'à présent9,10,11,12,13,14,15 et circule désormais sous plusieurs sous-variantes, notamment BA.1.1, BA.2 (B.1.1 .529.2) et BA.3 (B.1.1.529.3)2, créant un besoin médical urgent non satisfait en matière de prophylaxie et de thérapeutique.

Nous avons recherché la présence d'anticorps anti-spike dans des échantillons de sérum provenant d'une cohorte de plus de 100 donneurs et nous nous sommes concentrés sur un donneur post-infecté qui a reçu deux doses du vaccin à ARNm-1273 et présentait des taux d'anticorps sériques parmi les plus élevés, avec une excellente étendue. contre un panel de variantes du SRAS-CoV-2 dans un test de neutralisation de substitution trimérique Spike-ACE216. Le criblage des surnageants de clones de cellules B pour la liaison de pointes à haute affinité nous a conduit à donner la priorité à six clones pour la production de mAb via l'expression de chaînes lourdes et légères appariées dans des cellules ExpiCHO. Lors du profilage initial de ces mAb purifiés, P2G3 a présenté la plus forte affinité de liaison pour le trimère de pointe original du 2019-nCoV et un panel de protéines de pointe codant pour des mutations trouvées dans les COV Alpha, Bêta, Gamma et Delta (CI50 de 0,006 à 0,010 µg ml−1 ) (Données étendues Fig. 1a). Études de liaison cross-compétitives de pointe RBD réalisées avec un panel d'anticorps anti-SARS-CoV-2 autorisés ou cliniquement avancés (REGN10933 et REGN10987 de Regeneron17, AZD8895 et AZD1061 d'AstraZeneca18, ADG-2 d'Adagio19, S309/Sotrovimab de Vir/GSK20 ) et les mAb précédemment décrits par notre groupe21 démontrent que P2G3 se lie à un épitope unique, quoique chevauchant, avec ceux reconnus à la fois par AZD1061 et S309/Sotrovimab, ce dernier agissant par un mécanisme distinct du blocage de l'interaction RBD/ACE220 (Extended Data Fig. 1b). Il est important de noter que notre mAb de classe 1 puissant et largement actif, P5C3, s'est lié de manière non compétitive au RBD avec P2G3, nous incitant à profiler ces mAb à la fois seuls et en combinaison pour des études ultérieures.

42-fold more potent than ADG-2, AZD1061, AZD8895, REGN10933 and REGN10987 mAbs and 19-fold more potent than Sotrovimab at neutralizing Omicron BA.1 spike-pseudotyped lentiviral particles (Fig. 2b). Second most potent was P5C3, with an IC80 value of 0.223 µg ml−1, and the P2G3/P5C3 combination revealed a minor-enhanced activity over P2G3 alone in this assay, with an IC80 value of 0.024 µg ml−1 for the total concentration of the two mAbs. Furthermore, P2G3 and P5C3 maintained full neutralizing activity against the ancestral D614G and Omicron BA.1.1 encoding the R346K spike pseudovirus (Extended Data Fig. 2a,b), a mutation present in ~10% of Omicron variant sequences in the GISAID11./p>10× less potent than P2G3, P5C3 and both the AZD and REGN cocktails against this virus./p>6.2 µg ml−1 at the time of viral inoculation and P2G3 treatment groups showed a significant ~4-log reduction of genomic viral RNA levels (Extended Data Fig. 4c)./p>1,200 Å2 (Fig. 5b and Extended Data Figs. 7a and 8a). To characterize the P2G3 paratope and epitope interface in detail, we performed local refinement of the P2G3 Fab-RBD interacting region and reached a resolution of 3.84 Å with well-defined density, allowing clear interpretation of sidechain positions (Extended Data Figs. 6 and 8, and Supplementary Fig. 2 and Data Table 1). The P2G3 paratope is composed of four complementarity-determining region (CDR) loops binding at the back of the RBD. The interactions are mediated through electrostatic and hydrophobic contacts (Fig. 5c,d and Extended Data Fig. 8b,c) and involve 16 residues of the RBD, mainly bound by the heavy chain of the P2G3 mAb. The 18-residue-long CDRH3 sits at the top of a loop that comprises residues 344–347, and also contacts the amino acids at the limits of the 5-stranded β-sheet (residues 440–451), overall accounting for >60% of the buried surface area (431 Å2) (Extended Data Fig. 8a–c). The interactions between P2G3 and the Omicron RBD are conserved in both RBD-up and RBD-down states (Extended Data Fig. 8c,d). CDRH2 extends the epitope by interacting with R346 that is engaged by residue W53 via a potential cation-pi interaction (Fig. 5d and Extended Data Fig. 8e), an interaction that is probably conserved with the R346K spike substitution (Extended Data Fig. 2a,b). The only potential contact from the light chain derives from the CDRL1 Y32 forming a hydrophobic interaction with V445 of the RBD (Extended Data Fig. 8c). Moreover, P2G3 is only observed to contact RBD amino acid residues and the distance to the nearest atom of the glycan branch is ~10 Å from P2G3. Importantly, the epitope defined by our structural studies rationalizes the potent neutralizing activity of P2G3 against the Omicron variant relative to other Class 3 mAbs. Omicron mutations S371L, N440K, G446S and the minor R346K sub-variant are all situated outside of, adjacent to or have little effect on recognition of the P2G3-binding epitope, whereas two or more of these mutations directly impinge on epitopes recognized by REGN10987, AZD1061 and S309/Sotrovimab (Fig. 5e). Furthermore, P2G3 displays a unique binding orientation on the RBD, with its Fab angling away from most of these Omicron mutations (Fig. 5f). In modelling the observed angles of attack of various Class 3 mAbs, it is possible that REGN10987 only binds to the up-RBD form while AZD1061 binds one up- and one down-RBD form, with steric hindrance blocking the third RBD site on the Omicron spike trimer (Extended Data Fig. 9). In contrast, P2G3 and S309/Sotrovimab probably binds both the up and down forms of Omicron RBD without clashes (Fig. 5g and Extended Data Fig. 9c), a characteristic that may contribute to the largely conserved and high potency of P2G3 across VOCs./p>99% by SDS–PAGE analysis. Biotinylation of spike or RBD proteins was performed using EZ-Link NHS-PEG4-biotin (Life Technologies) with a 3-fold molar excess of reagent following the manufacturer’s protocol. Biotinylated proteins were buffer exchanged with PBS using an Amicon Ultra-0.5 with a 3 kDa molecular weight cut-off. Spike and RBD tetramers were prepared fresh before use and formed by combining biotinylated proteins with PE-conjugated streptavidin (BD Biosciences) at a molar ratio of 4:1./p>100 donors were monitored for levels of IgG antibody binding to the SARS-CoV-2 spike trimer proteins from 2019-nCoV, D614G, Alpha, Beta and Gamma variants in the Luminex bead-based assay./p>1-log reduction in viral RNA and infectious virus anticipated in the lung tissue with an effective therapy that can provide statistically significant differences between treated and untreated animals. These sample size assumptions were confirmed in our statistical analysis. Statistical differences in viral RNA levels and infectivity were evaluated using the Mann-Whitney two-sided tests to compare control and treatment groups./p>

4000 cells analysed per condition. c, d) Antibody dependent cellular phagocytosis assay performed ancestral 2019-nCoV and with Omicron BA.1 variant Spike protein biotinylated and bound to streptavidin coated fluorescent beads. Beads mixed with the indicated antibody concentrations were incubated with the U937 monocyte effector cell line and antibody dependent cellular phagocytosis of the Spike coated beads was evaluated by flow cytometry. Dashed lines correspond to individual antibodies and solid lines indicate combinations of P2G3 and P5C3. Results shown are representative data for three separate experiments with each concentration response tested in duplicates or triplicates. Mean values ± SEM are shown./p>

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